Nature | 独特的PCO371结合位点——B类GPCRs的新型小分子激动剂结合口袋

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G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor，GPCR）是真核生物中最大的一类膜蛋白家族，至少编码800个人类基因。GPCR包含7个跨膜蛋白，通过其信号通路的协同作用调节重要的生理过程。GPCR基因表达的改变和信号转导的失调已被认为是恶性肿瘤的标志。细胞膜上特异性GPCR的异常表达可刺激细胞持续且不受调控地增殖并触发细胞内信号转导，最终导致肿瘤细胞的生长，诱导血管生成和转移。

针对GPCR超家族的成员，有多种不同的分类方法，比较流行的有两种：一是将GPCR蛋白分为谷氨酸类(Glutamate)、视紫红质类(Rhodopsin)、粘附类(Adhesion)、分泌素类(Secretin)、卷曲蛋白类（Frizzled/TAS2）这5类（缩写为GRAFTS）。另一种是面向所有生物体内的GPCR蛋白的A-F分类系统，这其中B类GPCR——分泌素受体家族是许多疾病的药物靶点，包括骨质疏松症、2型糖尿病、肥胖、骨代谢疾病。近年来，科学家们已经确定所有共15个含有肽激动剂的B类GPCR成员的结构，这为整个B类GPCR提供了激素识别和受体激活的重要分子机制[1]。

2023年7月31日，中国科学院上海药物研究所的徐华强课题组在Nature上发表了题为“Conserved class B GPCR activation by a biased intracellular agonist”的文章，该团队利用冷冻电镜技术，报道了B类GPCR人源甲状旁腺激素受体1（parathyroid hormone receptor 1，PTH1R）与Gs蛋白和小分子激动剂PCO371复合物的分辨率为2.57Å的结构，通过结构分析和功能实验发现了B类GPCRs的新型小分子激动剂结合口袋。

因为PCO371可以诱导环磷腺苷（cyclic Adenosine Monophosphate, cAMP）的产生达到与甲状旁腺激素（Parathyroid Hormone, PTH)相同的水平[2]，所以PCO371被认为是PTH1R的激动剂。因此，作者首先利用cAMP的积累证实了PCO371是G蛋白激动剂，但和PTH不同，PCO371在促进PTH1R介导的阻遏蛋白信号传导方面存在缺陷。这些数据表明：与PTH相比，PCO371是一种G蛋白偏向激动剂(图1a-c)。

图1 PCO371偏向激活G蛋白信号通路，但不激活阻遏蛋白arrestin信号通路；PCO371-PTH1R-Gs复合物冷冻电镜高分辨结构以及呈现的新型配体结合口袋。

然后，研究者展示了分辨率为2.57Å的PTH1R、Gs异源三聚体和小分子激动剂PCO371结合的冷冻电镜高分辨结构。PCO371的结合位点与以往报道的GPCR小分子或肽配体的结合位点完全不同，在PTH1R和G蛋白之间的界面处占据PTH1R的独特配体结合口袋(图1d-e)。此外，作者还展示了PCO371的结构，其由头部咪唑啉酮、中间二甲苯基、磺酰胺连接体、哌啶、螺咪唑酮和尾部三氟甲氧基苯基组成(图1f)。

图2 独特的PCO371结合位点——PCO371与PTH1R的相互作用

在PTH1R、Gs蛋白和PCO371复合物的结构中，PCO371呈U型，包裹住TM6的下半部分(细胞内半部分)(图2a-c)。PCO371的头部咪唑啉酮和中间苯基嵌入受体与Gα_s蛋白的界面，与TM2、TM6、TM7和H8内的残基以及Gα_s的α5螺旋形成相互作用(图2d-e)。PCO371的头部咪唑啉酮还与R219^2.46b形成氢键，并与Gα_s的α5螺旋的Y391形成极性相互作用。此外，PCO371的头部咪唑啉酮和中间苯基与Gα_s的受体和α5螺旋形成广泛的疏水相互作用(图2d-e)，而尾部苯基插入到去垢剂的胶束中，可能与天然系统中的脂质双分子层相互作用(图2f)。PCO371在PTH1R和G蛋白之间意想不到的界面结合证明了单个口袋残基在PCO371识别和特异性中的重要作用，几个突变体(V412A、M414A、L416A和F417A)被证明可以增强PCO371的效力(图2g)。

图3 PCO371的结合口袋

尽管所有活性 PTH1R 结构都是与G 蛋白以相同的方式结合，但是PCO371结合的PTH1R结构与PTH结合的PTH1R结构在胞外区上却有着构象差异：在PCO371结合的PTH1R结构中，TM6的胞外端向内移位7.0Å(图3a)，导致TM6的胞外端(残基M425^6.57b、Y421^6.53b和F424^6.56b)与PTH的N端残基(S1、V2和S3)发生碰撞(图3a)，这解释了PCO371可以抑制多肽与其跨膜区结合的报道。PTH与PTH1R结合的结构中位于TM6中间的保守PxxG基序(P415^6.47b-L416^6.48b-F417^6.49b-G418^6.50b)也与PCO371发生碰撞(图3b)，因此PCO371-PTH1R-Gs复合物结构中的PxxG基序向外移位，形成PCO371的结合口袋(图3b-c)。

图4 B类GPCR中PCO371对PTH1R的选择性及PCO371结合位点的保守性

研究者为了探究PCO371和PTH1R的结合相对于其余B类GPCR的选择性，他们在AD293细胞中采用转染的野生型PTH1R、PTH2R和GLP-1R受体进行了cAMP生成实验，通过检验cAMP的产量来衡量PCO371的选择性。他们发现PCO371在野生型PTH2R和GLP-1R中没有活性(图4a-b)，但是PTH2R的单一残基替换（L370^6.47bP）则会响应PCO371的诱导激活。另外，P415^6.47bA突变却使PTH1R失活无法响应PCO371，但仍然能被PTH完全激活(图4a,c)。该研究团队还基于PCO371结合的PTH1R结构进行了序列比对，值得注意的是，除了PTH2R中的L370^6.47b外，P415^6.47b是其他B类GPCR中TM6的保守残基(图4d)。因而，PTH受体中的P^6.47b是PCO371选择性激活PTH受体的关键残基。此外，序列比对的结果表明，PCO371结合界面在PTH1R和PTH2R之间具有3个非保守残基，在PTH1R和GLP-1R之间具有5个非保守残基，这意味着有可能将这些非保守残基定向突变为对应的PTH1R残基来实现其他B类GPCR与PCO371的结合。因此，研究者们对PTH2R和GLP-1R的非保守残基进行了对应PTH1R残基的突变，他们发现单突变残基（图4a）实现了PCO371对PTH2R的激活，而无论单一突变GLP-1R的哪一个残基都无法实现PCO371对GLP-1R的激活。于是，研究者对GLP-1R进行双残基突变、三残基突变以及五个残基全部突变为对应PTH1R的残基，结果都出奇的一致——PCO371对三种情况的激活程度基本相同（图4b），所以研究者得出结论——这两个残基对 PCO371 选择性起着关键性作用。

图5 在B类GPCRs中普遍存在保守的类似PCO371的结合口袋

单残基突变的PTH2R或双残基突变的GLP-1R可以激活PCO371的结果表明，在其他B类GPCR成员中可能存在类似的PCO371结合口袋。为了验证这一假设，研究者基于PCO371结合的PTH1R结构进行了同源性建模，他们发现在B类GPCR的其他成员中确实存在着这样的口袋，并且与PCO371与PTH1R的结合模式类似（图5a）。因此，该团队继续测试了这些B类GPCR与PCO371的结合能力（图5b），他们观察到七种野生型B类GPCR(GCGR、GIPR、PAC1R、GHRHR、SCTR、VIP1R和VIP2R)也可被PCO371激活。而GLP-1R、GLP-2R、PTH2R和CRF2R这四种B类GPCR的野生型受体则不能被PCO371激活，但是通过对它们结合口袋残基进行一个或两个的突变可以使它们对PCO371激活产生反应。基于这些结果，研究者得出结论，类似PCO371的结合口袋在B类GPCR中大部分是保守的。

原文链接

https://doi.org/10.1038/s41586-023-06467-w

参考文献

参考文献

[1] Fredriksson R , Lundin L G .The G-Protein-Coupled Receptors in the Human Genome Form Five Main Families. Phylogenetic Analysis, Paralogon Groups, and Fingerprints[J]. Molecular Pharmacology, 2003, 63(6):1256-1272.DOI:10.1124/mol.63.6.1256.

[2] Tamura T , Noda H , Joyashiki E ,et al.Identification of an orally active small-molecule PTHR1 agonist for the treatment of hypoparathyroidism[J].Nature Communications, 2016, 7:13384.DOI:10.1038/ncomms13384.

供稿 | 娄鑫垚

审稿 | 丛野

责编 | 囡囡

排版 | 可洲

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